通过CRISPR/Cas9基因编辑技术来精确调控内源基因的表达对于实现作物的精准设计和培育至关重要。CRISPR/Cas9技术在育种中最广泛的应用是对靶基因的敲除(gene knock-out)，从而实现对基因功能的丧失（loss-of-function）。然而，许多农艺性状的改善需要功能获得性等位基因（gain-of-function），也就是上调靶基因的表达，即基因敲高(gene knock-up)。因此，在不改变基因编码序列和转入新的基因组片段的前提下，开发通过基因敲除来上调基因的表达的新方法可以拓展现有的基因表达调控工具，为作物遗传改良以及野生植物从头驯化提供强有力的技术支撑。
2023年11月09日，中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队在Plant Communications在线发表题为“Genome editing of 3'UTR-embeded inhibitory region enables to generate gene knock-up alleles in plants”的研究论文。该研究通过对植物基因3'非翻译区 (3' untranslated region, 3'UTR)中的负调控区域进行敲除，开发了一种能够上调基因蛋白表达的新方法，对水稻和拟南芥的3个基因进行改造，获得性状成功改良的植株。
真核生物基因3'UTR主要通过调控mRNA的翻译来影响基因的精确表达。3'UTR负调控区域通常包含miRNA特异性识别的顺式元件或者形成比较稳定的RNA二级结构等来抑制翻译。因此，该研究推测通过CRISPR/Cas9技术敲除3'UTR负调控区域可以上调目标蛋白的表达，从而创制新的基因敲高等位基因型来改良植物性状。为验证这一设想，该论文选择了水稻中的耐低温基因OsLTT7 (low temperature tolerance 7)和矮秆基因OsSBI (shortened basal internodes)，以及拟南芥中的耐盐基因AtTPPD (Trehalose-6-Phosphate Phosphatase D) 进行研究。首先，采用3'RACE技术即cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA ends) 克隆和鉴定了目标基因的3'UTR序列。然后，采用基于原生质的双荧光素酶报告系统筛选对荧光素酶报告基因(LUC/REN)起最显著抑制作用的调控区域。最后，针对每个目标基因的3'UTR靶区域设计并构建了4个CRISPR/Cas9 sgRNAs对其进行编辑。作者对获得的无转基因的纯合突变体进行研究发现3'UTR负调控区域的删除使得OsLTT73'utr、OsSBI3'utr和AtTPPD3'utr突变体中靶蛋白的丰度都得到了提高。OsLTT73'utr、OsSBI3'utr和AtTPPD3'utr植株分别获得了耐低温、矮化以及抗盐的性状。基于此，本研究提出了创制基因敲高等位基因的技术路线图（图1）。
图1: 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术创制基因敲高等位基因来改良植物的性状
该论文的共同第一作者是中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队的博士后王洪文和博士生张达瀚，通讯作者为余泓研究员。中国科学院遗传与发育生物学研究所植物激素平台褚金芳博士、辛培勇博士和闫吉军博士参与了此研究工作。该研究得到了国家重点研发计划、中国科学院稳定支持基础研究领域青年团队计划、国家自然科学基金委以及中国科学院先导专项的资助。
