CRISPR-Cas技术已成为基因工程领域的通用工具，通过单一向导RNA（sgRNA）即可实现高效和低脱靶效应的位点特异性编辑。尽管CRISPR文库技术展现出大规模靶向遗传筛选潜力，但传统方法难以克服基因家族功能冗余导致的表型掩盖效应。为此，开发新的文库设计方法，充分利用CRISPR技术精准高效的特点，且保留传统方法的高可扩展性，可为农作物生产提供新的育种思路。
2025年5月2日，中国科学院大学张玉芹副教授团队与以色列特拉维夫大学Eilon Shani教授团队开展国际合作研究，在Nature Communications 在线发表了题为 Construction of multi-targeted CRISPR libraries in tomato to overcome functional redundancy at genome-scale level 的重要研究成果。该研究创新性地构建了番茄全基因组水平的多靶点CRISPR文库，为解决功能冗余导致的单基因突变表型被掩盖这一关键科学问题提供了突破性解决方案，为番茄分子育种和功能基因组学研究提供了宝贵的遗传资源。
研究团队针对CRISPR技术应用中存在的关键瓶颈问题展开攻关，创新性地整合了前期开发的文库设计策略，通过设计同时靶向多个序列保守基因的特异性sgRNA，实现了对功能冗余基因家族的高效协同编辑。采用系统生物学方法及分子遗传学技术，成功构建了包含15,804个独立sgRNA的高质量文库，可靶向番茄中34,075个基因中的10,036个（图1）。并根据目标基因的功能将sgRNA文库分为10个子文库。子文库1-9靶向转运蛋白、转录因子和酶的特定家族，子文库10靶向所有其他剩余基因。为确保大规模筛选的准确性和可追溯性，研究团队创新性地开发了CRISPR-GuideMap条形码追踪系统，以高通量方法快速获得突变体库不同株系的sgRNA。
（图1）番茄全基因组多靶点CRISPR-Cas文库遗传转化流程
为证明该工具在克服基因功能冗余方面的稳定性和适用性，研究人员将子文库1转化至背景材料番茄M82 sp-中，该子文库涵盖502条sgRNA，靶标3个转运蛋白家族（ABC，MFS和DMT）的199个基因。通过监测该群体在标准和低施肥条件下的生理和发育异常情况，初步筛选鉴定到了一个对病原体过敏感的突变系npf1.10/11/12和一个对养分缺乏过敏感的突变系pt2/pt6，并初步明确了基因功能。研究人员以同样的方式将靶向转运蛋白的子库2和子库3，以及靶向转录因子的子库4和子库5转化至番茄Ailsa Craig中，创制了1,062个独立株系，并对番茄果实大小、形状和可溶性固形物含量（Brix）等果实品质相关的性状进行调查，筛选鉴定了125个具有果实相关表型的株系。与对照植株的果实相比，其中6个突变株系在果实直径、尖端长度和Brix含量等性状差异显著。靶标基因鉴定和对应基因家族成员的研究进展具有较高的一致性，同时提示其中一些转录因子可能存在潜在的新功能机制。
该研究开发了首个番茄全基因组水平的多靶点CRISPR文库，创制了约1,300个独立的CRISPR编辑株系，并鉴定出100多个具有显著表型变异的突变体株系，表型涉及果实形态建成（大小和形状）、风味物质合成、病原体应答及营养吸收等多个重要农艺性状。研究还创新性地整合了精准靶向编辑与深度测序技术，使基因功能鉴定的效率和准确性大幅提高。
以色列特拉维夫大学植物科学与食品安全学院Eilon Shani教授和中国科学院大学现代农业科学学院张玉芹副教授为共同通讯作者。以色列特拉维夫大学博士生Amichai Berman和中国科学院大学在读博士生苏宁为该论文第一作者。该研究得到了以色列科学基金会、ERC、中国科学院率先行动引才计划、中国科学院大学校自主部署项目等资金支持。
