根系微生物群赋予水稻在酸性土壤中铝毒和磷缺乏的抗性
Root microbiota confers rice resistance to aluminum toxicity and phosphorus deficiency in acidic soils
Article, 2023-10-2, Nature Food, [IF = 23.2]
DOI：10.1038/s43016-023-00848-0
原文链接：https://www.nature.com/articles/s43016-023-00848-0
第一作者：Chaoyang Liu (刘朝阳), Meitong Jiang (姜美彤)，Mengting Maggie Yuan (袁梦婷)
通讯作者：Yuting Liang (梁玉婷)
合作作者：Ertao Wang (王二涛), Yang Bai (白洋), Thomas W . Crowther , Jizhong Zhou（周集中）, Zhiyuan Ma (马志远), Li Zhang (张理), Yu Wang (汪玉), Jixian Ding (丁骥贤), Wuxing Liu (刘五星), Bo Sun (孙波), Renfang Shen (沈仁芳), Jiabao Zhang (张佳宝), Yuting Liang (梁玉婷)
主要单位：
1 中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室 (State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing, China)
2中国科学院大学 (University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100049, China)
3 加州大学伯克利分校环境科学、政策和管理系 (Department of Environmental Science, Policy and Management, University of California, Berkeley, CA, 94720, USA)
4 中国科学院植物生理生态研究所，中国科学院分子植物科学卓越创新中心，植物分子遗传学国家重点实验室 (Department of Environmental Science, Policy and Management, University of California, Berkeley, CA, USA)
5 中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室 (National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Institute of Plant Physiology and Ecology, SIBS, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)
6 瑞士苏黎世联邦理工学院综合生物学研究所环境系统科学系 (Department of Environmental Systems Science, Institute of Integrative Biology, ETH Zurich, 8092, Switzerland)
7 美国俄克拉何马州诺曼市俄克拉荷马大学微生物与植物生物学系 (Institute for Environmental Genomics, Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman, OK 73019, USA)
- 摘要 -
在酸性土壤中，铝毒性严重阻碍了作物的生长，全球范围内，它仅次于干旱，成为第二大非生物性胁迫因子。尽管关于植物对抗铝毒性的机制已有大量研究并取得了重要进展，但土壤微生物如何以及是否能增强作物对铝毒的抗性仍有待探索。我们的研究揭示，由从水稻根际中筛选出的高耐铝菌株构建的合成微生物菌群（SynCom）能在酸性田间环境中提升水稻产量高达26.36%。这些SynCom不仅能够有效获取根际的碳资源并稳定定殖在根际，还能通过胞外质子化反应来缓解土壤的酸化和铝毒性。此外，植物与这些微生物之间的协同作用为提高表层土壤中的遗留磷（legacy phosphorus）利用率开辟了新的路径。这些发现突显了利用微生物策略在酸性土壤中推进可持续农业的巨大潜力。
- 介绍 -
酸性土壤（pH < 5.5）占世界潜在耕地的40%至50%，约覆盖全球3950万公顷的土地。在这些土壤中，作物往往受到铝（Al）的毒性胁迫，它被认为是仅次于干旱的第二大非生物胁迫。酸性土壤中溶解的Al3+会对植物根系造成严重损害，导致根系伸长减少40%并影响其健康发育。铝在根部内部会抑制细胞的分裂、伸长和膜极化，并降低叶片的光合效率及色素含量。此外，铝还会引起活性氧的过度积累，进而干扰细胞壁蛋白和其他代谢路径，导致作物矿质营养不足和生产性能下降。
世界上大约13%的水稻生长在酸性土壤中，这些地区主要位于热带和亚热带。尽管水稻抗铝毒性的生理、遗传和分子机制已被深入研究，并且抗铝基因为培育高产植物品种提供了有价值的靶点，但在酸性土壤中，植物与微生物的互利互惠关系仍然被低估，这为增强作物的铝抗性和生产力提供了新的机会。
根际微生物为作物提供了关键的抗逆和生长支持。植物根际促生菌（PGPR）为植物提供了一系列重要的生物学功能，如增强营养吸收、提高对病原体和逆境的耐受性。许多研究发现，PGPR通过释放有机酸和铁载体改变金属的生物可利用度，从而赋予植物对重金属（如镉、铜和锰）的耐受性。合成群落（SynComs）是具有植物有益性状的单个微生物培养物的集合。在无菌条件下，它们已被证实可以调节植物的营养吸收或抑制病原菌。具有所需功能性状的PGPRs可作为SynComs的候选菌株，以促进胁迫条件下宿主的生长和健康。一些耐铝PGPRs的发现启发了我们通过微生物策略探索在酸铝胁迫下提高水稻产量的潜在途径，比如Paenibacillus yonginensis DCY84和Rhodotorula mucilaginosa CAM4。这些微生物是否能在促进水稻生长的同时减少铝的毒性？其背后的机制是什么？这些问题的答案将为我们设计功能性SynCom并为植物提供长期的抗铝保护提供方向。
考虑到酸性土壤中铝毒对根系造成的严重损害和伴随的缺磷症状，我们假设施用耐铝SynCom可以通过优化根系形态和改善土壤养分有效性来提高水稻的铝抗性。我们的目标是（1）鉴定耐铝细菌并开发高效的耐铝SynCom；（2）评估SynCom促进水稻生长的有效性；（3）阐明SynCom在水稻抗铝和促磷吸收方面的潜在机制。在广泛分布的酸性土壤中，本研究为提高作物产量和农业可持续发展提供了一种基于植物-土壤-微生物相互作用的解决方案。
- 结果 -
1. 耐铝SynCom的评估与开发
Al-resistance evaluation and development of the SynCom
为了鉴定耐铝细菌并开发高效的耐铝SynCom，我们从生长于田间酸性土壤的水稻（南粳46）根际中分离获得了421株细菌，并构建了248株细菌文库。根际土壤pH约为4.86，Al3+含量为0.62 mg。这些细菌可能在酸铝土壤中对水稻有益，可以作为 SynCom的候选菌株。根据它们在根际的相对丰度和属水平上的系统发育关系，我们基于拉曼-D2O方法对文库中12株代表性菌株在pH = 4.0时的耐铝水平进行了评估。C-D比值表明，在5 mM Al3+添加条件下，Pseudomonas sp.和Rhodococcus sp.的耐铝活性最强。Al3+浓度依赖性生长曲线（0 ~ 1.0 mM Al3+, pH = 4.0）证实Pseudomonas sp.和Rhodococcus sp. 为耐铝菌株并进一步鉴定为P. aeruginosa和R. erythropolis。R. erythropolis和P. aeruginosa在根际的相对丰度分别为0.032%和0.013%。
尽管已经有实验室研究报道了R. erythropolis和P. aeruginosa的代谢多样性和对植物的有益性状，但它们对铝的耐受性或保护植物免受铝胁迫的能力尚不清楚。通过盆栽试验，我们发现单次接种R. erythropolis和P. aeruginosa可使水稻茎部和根系生物量分别提高73.8 ~ 74.9%和78.7 ~ 108.2%，而共接种可使水稻植株生物量比未接种时提高297.4 ~ 308.1%。因此，将R. erythropolis和P. aeruginosa共培养作为耐铝SynCom，以下简称RP。
2. SynCom促进水稻生长，减轻铝毒性
SynCom promoted rice growth and alleviated Al toxicity
在田间和温室条件下，我们研究了SynCom对酸铝土壤中（Al +、Al + RP）的水稻生产性能和产量的影响。在田间条件下，接种SynCom显著提高了水稻生育期的株高、叶片叶绿素含量和成熟期的籽粒产量，分别增加了4.15%、9.81%和26.36%（Al + RP vs. Al +）（图1a和b）。盆栽试验证实了这种促进效果（图1c）。随后，我们利用16S rRNA qPCR技术在盆栽试验中证实，R. erythropolis和P. aeruginosa都能在水稻根际稳定定殖，并在拔节和抽穗期丰度显著增加。
此外，由于过氧化物酶能够清除由重金属如Al导致的活性氧的过度积累，我们发现接种SynCom后，根组织中的过氧化物酶活性显著提高了128.3%（Al + RP vs. Al +）。透射电子显微镜和X-射线能量色散能谱显示，根组织中Al含量降低（图1d）。我们进一步发现，接种SynCom后，盆栽试验收集的根组织中Al含量降低了26.5%。
图1 SynCom对铝毒性酸性胁迫下水稻生产性能的促进作用
a-c，南粳46在田间（a、b）和盆栽试验（c）不同生育期中的表型和籽粒产量。
d，通过透射电镜观察Al在水稻根系中的分布。红色“a”代表细胞间物质，红色“b”代表Al，红色“c”代表细胞壁。
我们比较了接种SynCom在酸铝和非酸铝土壤上的促生效果。我们通过将CaCO3添加到土壤中，将土壤的pH值提高到5.5以上使Al3+沉淀（以下简称LS和LS + RP）。在对4个不同水稻品种（粳稻：南粳46和日本晴，籼稻Shanhanzinuo 和Jinguoyin）进行的试验中，发现SynCom显著提高了叶绿素含量、生物量和根冠比，分别提高了10.3%到155.8%、525.4%和16.3%（Al + RP vs. Al +），无酸铝土壤（LS + RP vs. LS）则分别提高了6.94-82.9%、228.7%和22.0%。此外，接种SynCom的水稻生长表现优于LS的水稻（Al + RP vs. LS + RP），如叶绿素含量提高0.06 ~ 23.3%和生物量提高8.77%。为了更明确地控制不同营养物质之间的化学相互作用，我们在没有土壤的粘土基质系统中进行了植物生长促进试验。我们发现，在0 mM Al3+和pH = 4.0的条件下，SynCom在低磷（0.5 mgL-1）条件下的促进效果优于高磷（6 mgL-1）条件下的促进效果。在pH = 4.0条件下，随着Al浓度的增加， SynCom在低磷和中磷（2.5 mgL-1）处理下对水稻生长的促进作用更好。这些结果表明，对于酸性土壤中的作物生长，SynCom更具有效性。
3. 水稻根系构型优化研究
Optimization of root architecture
鉴于铝毒直接抑制了根系的伸长，导致根系短小且发育不良，我们进一步研究了SynCom是否会改变根系的发育情况。首先，我们对4个水稻品种的根系形态进行了扫描。在铝胁迫下，SynCom处理促进了根系的生长。更重要的是，与LS + RP处理相比，Al + RP处理的根系长度和根尖分别增加了0.45 ~ 75.3%和5.48 ~ 50.00%，而根系平均直径和体积分别减少了14.1 ~ 44.5%和25.6 ~ 44.5%。这表明SynCom促进了植物在酸性土壤中细根和根毛的发育，这是一种植物在养分缺乏环境中获取资源的策略。
我们使用CT扫描进一步可视化了三维原位根结构（图2a）。结果证实，与其他处理相比，Al + RP处理的根长最长，根直径最小（图2b）。我们发现，SynCom使Al + RP vs. Al +和LS + RP vs. LS的根角分别降低11.6°和1.7°。有趣的是，与LS + RP相比，接种SynCom后Al + RP的根角平均减小了2.78°，这表明更多的根向土壤表面生长（图2c）。
为了验证根角的变化，我们设计了一个平面根盒，使根系充分生长和伸展。原位摄影和根系绘图（图2d）可以直观地显示根的角度。与CT扫描结果一致，根箱结果进一步表明，接种SynCom后，水稻形成了更长、更细和更浅的根系（图2e和f）。
综上所述，SynCom接种后水稻在酸性土壤中形成了更长、更细和更浅的根系。我们推测，这可能与土壤剖面中Al含量和养分的变化有关。根构型的这种变化通常被认为是植物对逆境缓解和养分获取的策略，特别是浅根型的变化。
图2 不同处理条件下接种SynCom对水稻根系构型的影响
a，利用x射线CT技术，对南粳46土壤下的原位三维水稻根系结构进行了无损可视化。比例尺表示1厘米。
b-c，CT图像上根直径、总长度和根角的差异。
d，根箱法和描根法可视化南粳46原位二维根系构型。红线表示从图像中追踪到的根。
e，南粳46根箱内根角的时空动态变化。
f，南粳46根系角度的差异。
4. Syncom介导的Al毒性降低
SynCom-mediated reduction in Al toxicity
由于根伸长可能意味着土壤中铝毒性降低，我们分析了沿土壤剖面pH值和Al3+含量的变化。接种SynCom后，表层土壤pH从5.15显著增加到5.79，Al3+含量从0.53 mg L-1下降到0.19 mg-1（0-4 cm）（图3a）。同时，qPCR结果表明SynCom在表层土壤（0-4 cm）中富集（图3b）。
为了验证SynCom是否与植物建立了互作关系以及对与植物直接相关的微生物群落的影响，我们使用DNA-SIP区分了代谢13C标记的根系分泌物的根际细菌群（图3c）。PCoA表明，接种SynCom后，利用根际碳的细菌群落发生了显著变化。在属水平上，Pseudomonas在13C标记组显著富集，这意味着这些细菌能够利用植物光合碳（图3d）。Rhodococcus也被13C标记，但富集程度较低（图3e）。qPCR结果显示，Al + RP中13C标记的R. erythropolis和P. aeruginosa的相对丰度分别比Al +中增加了11.4%和35.7%。网络分析显示，接种SynCom后，Rhodococcus、Pseudomonas和其他分类群之间的关系变得更加简单。Rhodococcus与Phormidium IAM M-71呈正相关，而Pseudomonas与Conexibacter、Acidothermus和JG30a-KF-32 I始终呈负相关。SynCom接种也改变了微生物群落的组成，在13C标记群落中（Al + RP vs. Al +），根际溶磷菌Bacillus、Clostridium、Chryseobacterium和Flavobacterium的丰度增加。其中，Flavobacterium具有一种磷酸盐不敏感磷酸酶PafA，能够快速矿化有机磷。
为了确定接种SynCom提高土壤pH值的可能机制，我们研究了P. aeruginosa的胞外质子化过程。傅里叶变换红外光谱和zeta电位的结果分析表明，细菌有机阴离子的质子化作用抑制土壤酸化的主要因素（图3f）。Pseudomonas表面丰富的有机阴离子官能团（-COO-或-O-）与质子（H+）相互作用形成中性分子（图3f）。SynCom在0.3 mM和0.5 mM Al3+（pH = 4.0）条件下，使土壤活性菌的耐铝性能力分别提高了47.7%和105.6%。表层土壤pH值的增加促进了Al3+被螯合和固定化，从而降低了对植物和根际微生物的毒性。在9-10 cm土层中，SynCom增加了Al3+含量，这可能是由于更多的磷酸酶分解了Al-P化合物，同时也有少量的Al在溶解和淋溶的作用下在底层逐渐积累。尽管如此，在接种SynCom后，较深的水稻根系对Al的敏感性降低。
图3 接种SynCom后土壤化学性质和细菌群落的变化
a，不同土壤剖面深度的pH和Al3+浓度。
b，qPCR检测SynCom定殖。红色和绿色星号（*）表示在相同的土壤深度下，Al + RP的丰度明显高于Al +。
c-e，用13C-DNA-SIP法测定SynCom对细菌群落的影响。（d）和（e）中的蓝色和红色箭头分别表明假单胞菌和红球菌的丰度在12C-Al + RP vs. 12C-Al +和13C-Al + RP vs. 13C-Al +中增加。
f，不同pH值下铜绿假单胞菌与质子的相互作用。
5. SynCom促进表层土壤磷的活化
SynCom promotes surface soil P mobilization
为了确定接种SynCom后植物形成浅根构型是否与磷有效性的变化有关，我们在土壤深度剖面上研究了磷的形态和组分（图4a）。接种SynCom后，表层土壤（0 ~ 4 cm）中的有机磷和残留磷含量分别下降了61.1%和9.51%，而有效磷含量在该深度没有显著差异。这可能意味着表层土壤中的有机磷和残留磷被更多地转化为有效磷，可供植物和微生物利用。此外，我们发现在酸性土壤与外源添加磷均匀混合后，植物的根长、直径和根尖数量不再受到SynCom的影响。
拉曼-D2O方法表明SynCom使表层土壤细菌群落的残留磷溶解能力提高了37.2%（图4b）。酸性磷酸酶（ACPs）和碱性磷酸酶（ALPs）是主要用于有机磷矿化的酶，由植物和微生物产生。我们通过原位土壤酶活性分析测量了土壤剖面中的ACPs和ALPs活性（图4c）。SynCom显著提高了ALP活性，特别是在2 ~ 4 cm的表层土壤中，并在一定程度上恢复了ACPs的活性。phoD基因被认为是土壤中编码ALP的关键基因，被广泛用作ALP活性微生物群落的生物标志物。我们分析了携带phoD细菌的组成，发现作为最丰富的携带phoD分类群，Pseudomonas在SynCom接种后相对丰度由0.0087%增加到9.17%（图4d）。此外，携带phoD基因的Rhodococcus的相对丰度从0.0015%增加到0.016%。
有趣的是，我们发现R. erythropolis（SynCom的成员）在在调节土壤磷有效性方面具有潜在的独特功能。透射电镜分析显示，R. erythropolis形成了一个由聚磷酸盐（polyP）组成的寡体（图4e）。铝胁迫（pH = 4）下，R. erythropolis的polyP积累量增加46.6% ~ 55.2%。这种细胞结构参与了磷的储存、pH稳态、渗透调节和营养胁迫条件下的应激反应。此外，在转录组水平上，我们发现铝胁迫增加了R. erythropolis中编码polyP合成、积累和解聚的基因的表达。
图4 铝毒性酸性胁迫下，SynCom的定殖有助于水稻获取表层土壤磷
a，不同土壤剖面深度下磷的不同形态和组分。Po代表有机磷。
b，Al +和Al + RP处理下表层土壤微生物群落的溶解残留磷能力。
c，根际原位磷酸酶活性。
d，根际土壤中前15位phoD细菌属。红色箭头表示与Al +相比，假单胞菌属的丰度在Al + RP增加了。
e，在0 mM, 0.1 mM和1.0 mM条件下（30°C），通过透射电镜图像和拉曼光谱观察R. erythropolis中polyP的形成。
6. 根系微生物群与水稻之间的“C−P”交换
“C−P” exchange between the root microbiota and rice
表层土壤中较丰富的磷与浅根类型促进了水稻植株的磷转运。例如，OsPHO1;3和OsPHO1;1在叶片中的表达显著增加，OsPHO1;3和OsPht1;2在根中的表达显著增加（图5a）。据报道，OsPht1;2基因对磷酸盐从根到芽的长距离运输至关重要。我们发现，SynCom显著降低了磷的根冠比50.2%。此外，NRAT1表达的增加有助于水稻对铝的抗性（图5a）。NRAT1是一种质膜定位的铝转运蛋白，能够将Al3+隔离到液泡中。与此同时，促光素基因PHOT1a、光敏色素基因PHYA和PHYC以及蔗糖转运基因OsSUT4的表达显著增加。结果表明，SynCom促进了植株的光合作用和蔗糖的长距离运输，促进了根系的生长。根分泌更多的单糖供根际微生物作为碳源（图5b）。因此，通过“C−P”交换，根际微生物和植物之间建立了正反馈（图6a）。
图5 水稻抗铝反应增强为根系微生物群提供了更多的碳
a，SynCom促进水稻叶片和根系中磷饥饿、光合作用和铝转运体相关基因的表达。
b，土壤系统中的根系分泌物。
- 讨论 -
土壤-植物-微生物相互作用对植物健康至关重要。本研究揭示了酸铝土壤中根系微生物群对植物健康的影响。首先，我们发现由高耐铝细菌组成的SynCom通过质子化作用延缓表层土壤酸化并降低铝含量（图6b）。这一过程降低了植物根组织和微生物暴露在铝毒下的风险。接着，SynCom与本土微生物群协同作用，从表层土壤的残留磷和有机磷中释放磷酸盐。植物根系发展为有利于捕获磷的浅根构型，增强了磷的吸收和运输、光合作用以及蔗糖从地上部到根系的运输。更多的碳被分配到根中以产生更多的碳和能量来源，以招募有益微生物，包括接种的SynCom成员。
图6 SynCom如何赋予水稻铝抗性和植物在酸性土壤中的生长的假设机制
a, SynCom铝毒性酸性胁迫下的水稻。
b，表层土壤中发生的铝耐受和磷增溶过程。
拉曼-D2O光谱是一种在单细胞水平上阐明代谢活性的不依赖于培养的方法。该方法为优化耐铝SynCom的设计提供了有效的途径。从土壤中高通量筛选耐铝菌株可以扩大菌株候选库并优化SynCom设计。由于真菌和其他真核生物在促进土壤和植物健康方面具有重要功能，因此它们与细菌的相互作用以及在赋予植物抗铝性方面的作用需要进一步评估。此外，还需要进一步的工作来评估复杂农业系统中更多样的耐铝微生物，包括细菌、真菌和其他分类群，并评估它们的组合对土壤结构和功能的长期影响。
将微生物产品（单菌株或降低复杂性的菌群）的应用从实验室扩展到田间试验以促进植物健康和抗胁迫能力仍然具有挑战性。其中，一个主要障碍是微生物菌种难以在土壤群落稳定定殖。在本研究中，从水稻根际分离的SynCom成员能够再次被水稻根系招募并占据稳定的生态位，尤其是P. aeruginosa。它们通过促进磷的活化并与植物进行碳交换，建立了根际微生物群和植物之间的交流，从而增强了土壤功能。这些观察结果表明，重新引入本地物种而不是引入外来物种可能更有利于促进接种微生物在植物-土壤系统中的建立和生存。因此，筛选本土微生物可能是开发提高农业生态系统功能和对抗其他非生物胁迫的微生物产品的一种更为可行的措施。然而，关于植物如何招募SynCom成员的分子基础还需要进一步研究，例如在水稻中是否存在一个或多个数量性状位点来丰富特定的SynCom成员。
土壤酸化和铝毒性是全球农作物生产的最大障碍之一。我们的研究结果表明，在酸铝土壤中，接种SynCom表现出很好的促进植物生长和提高产量的效果。接种本地微生物所带来的扰动较小。这种微生物策略可能作为一种更为安全和可持续的方法来推广，对环境的不良影响较小。然而，需要更多的数据来评估接种SynCom对农业系统土壤结构和功能的长期影响。
磷安全正在成为21世纪全球最大的可持续性挑战之一，在整个粮食系统中，磷的低效利用正威胁着不断增长的粮食需求。目前，低磷有效性限制了60%以上的农业用地，特别是热带和亚热带地区的酸性土壤。在固磷土壤中，作物生产的磷利用效率有待提高。SynCom能够增强植物和微生物之间的“C -P”交换，有助于有机磷的矿化和残留磷的增溶。植物和微生物之间的功能性协调为增加土壤中遗留磷的利用提供了一条有希望的途径，从而减少磷肥在农业受胁迫地区的投入需求。
综上所述，我们的研究表明，施用耐铝SynCom显著提高了水稻的抗铝能力，缓解了土壤磷缺乏。在根际保持高丰度的SynCom通过质子化作用提高了土壤pH并降低了Al3+，提高了ALP活性并使根构型向浅根型发育，更有效地利用土壤中的有效磷。水稻生长和产量、根系微生物组和土壤条件之间的相互依赖表明在农业生态系统中需要考虑植物-土壤-微生物群的内在整体性。利用微生物策略（如定制的SynComs）是促进可持续农业发展，改善植物生长、产量和抗性的一种有前景的方法。
参考文献
Liu C, Jiang M, Yuan M, Wang E, Bai Y, Crowther T W, Zhou J, Ma Z, Zhang L, Wang Y, Ding J, Liu W, Sun B, Shen R, Zhang J, Liang Y. (2023), Root microbiota confers rice resistance to aluminum toxicity and phosphorus deficiency in acidic soils. Nature Food. https://doi.org/10.1038/s43016-023-00848-0
Research Briefing: Aluminium-resistant bacteria boost crop yield in acidic soils. Nature Food. https://doi.org/10.1038/s43016-023-00863-1
